第一代Sanger測序法，由Sanger等在1997年提出，基本原理是通過雙氧核糖核苷酸進(jìn)行延伸反應(yīng)，生成相互獨(dú)立的若干組帶放射性標(biāo)記的寡核苷酸，再通過凝膠電泳使它們分開，最后通過放射顯影讀出待測DNA上的核酸序列。
第二代（Next-generation sequencing，NGS）高通量測序法，引入可逆終止末端，并對其熒光標(biāo)記，從而實(shí)現(xiàn)邊合成邊測序。優(yōu)點(diǎn)是高通量，可定量，成本低廉，但是讀長較短，一般不超過500bp。
第三代測序技術(shù)即單分子測序技術(shù)，包括單分子實(shí)時(shí)（Single Molecule Real-time，SMRT）測序技術(shù)和單分子納米孔（Nanopore）測序技術(shù)，優(yōu)點(diǎn)為超長讀長且無需擴(kuò)增。
雖然第三代測序已經(jīng)商用了，但目前主流測序技術(shù)還是NGS，以下從其測序過程對其簡單介紹。
一、文庫構(gòu)建
1、基因組文庫構(gòu)建
① 通過物理性（超聲波法、噴霧法或水動力剪切等）機(jī)械打碎和酶消化切割等手段將提取到的基因組DNA隨機(jī)打斷。
② 打斷的DNA片段末端可能帶有5’—凸出和3’—凸出，且其末端不一定存在磷酸基團(tuán)或者羥基基團(tuán)。因此，需要使用Taq聚合酶補(bǔ)齊不平的末端，同時(shí)使用Klenow 酶在兩個(gè)末端添加堿基A。此過程即為末端修復(fù)，修復(fù)后的即可鏈接測序接頭。
③ 測序接頭是已知的用于測序識別的序列，包括有與固定在流動槽中寡核苷酸序列互補(bǔ)的序列（P5/P7）和簇生成引物序列（Read SP）以及標(biāo)簽序列（Index），添加完接頭序列的DNA片段集合即為所建基因組文庫。
④ 建庫過程中含有聚合酶、連接酶等以及其他各種雜質(zhì)，需要對其進(jìn)行磁珠純化，純化過程中同時(shí)進(jìn)行片段選擇。純化后的片段兩端是不互補(bǔ)的Y形結(jié)構(gòu)，不能直接進(jìn)行測序，所以還要進(jìn)一步用與接頭互補(bǔ)的引物來PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增完，進(jìn)一步磁珠純化，洗去雜質(zhì)。
2、轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建
轉(zhuǎn)錄組是指特定細(xì)胞或組織中全部轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，包括信使RNA（Messenger RNA,mRNA）、核糖體RNA（Ribosomal RNA,rRNA）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（Transfer,tRNA）以及其他非編碼RNA（noncoding RNA,nc RNA）。不同類型的RNA文庫制備方法各不相同，主要過程有：
① 目標(biāo)RNA富集，方法包括靶向捕獲目標(biāo)RNA和消除rRNA。前者通常使用Oligo-dT與Poly（A）雜交的特性設(shè)計(jì)探針，從而實(shí)現(xiàn)總RNA中捕獲到聚腺苷酸化RNA；后者方法較多，包括有Ribo-Zero-seq法、RNA消化酶法以及根據(jù)rRNA特性來消除rRNA的方法等。
② 通過化學(xué)方法或者酶消化的方法打斷富集到的RNA，或者將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，運(yùn)用DNA片段化方法打斷cDNA。
③ 連接接頭。cDNA測序接頭連接方法與DNA建庫方法一致；小RNA長度20—35nt且5’端有磷酸基團(tuán)、3’端有羥基基團(tuán)，因此不需要特殊修飾即可與接頭連接。
NEBNext Ultra II ＲNA 試劑盒( New England Biolabs) 文庫制備流程
二、成簇Cluster Generation
利用有單鏈引物的流動槽將DNA分子片段固定在流動槽上擴(kuò)增，形成單克隆DNA簇。
① 文庫片段（P5/P7）與芯片表面引物互補(bǔ)配對，被固定后進(jìn)行DNA復(fù)制。復(fù)制完后解鏈，將文庫片段洗去，留在流動槽表面的即為文庫模板互補(bǔ)的DNA鏈。
② 留下的互補(bǔ)鏈與原先模板鏈連接的引物結(jié)合，形成單鏈橋，再在聚合酶的參與下生成互補(bǔ)鏈，最終形成雙鏈橋。
③ 雙鏈橋再次變性后形成單鏈，形成的單鏈又分別與自己配對的引物結(jié)合，重復(fù)這個(gè)循環(huán)，形成散布在芯片上的DNA簇。
④ 進(jìn)一步再切斷洗去反向鏈（與模板鏈一致），僅留下正向鏈，且封鎖3’端防止重新形成單鏈橋。
成簇Cluster Generation
三、測序Sequencing
向已經(jīng)處理過的流動槽中添加改造過的DNA聚合酶和帶有熒光標(biāo)記的可逆終止dNTP（3’-OH鏈接疊氮基團(tuán)，在延伸時(shí)被阻止連接下一個(gè)dNTP），統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號結(jié)果，就可以得知每個(gè)模板DNA片段的序列。由于測序儀每次測序時(shí)的通量比較大，所以每次測得的序列可能不止一個(gè)樣本，為了做區(qū)分，在建文庫時(shí)在接頭序列加入不同Index（或Barcode）區(qū)分來源。
現(xiàn)在主流測序方法為雙末端（Paired-end）測序，因?yàn)榭梢栽鲩L測序長度且方便分析結(jié)構(gòu)變異。一般是洗掉前面復(fù)制好的合成片段，單鏈繼續(xù)在流動槽表面形成“橋式連接”。NaOH使雙鏈變性為單鏈，并洗去已經(jīng)測序完成的P7上DNA，留下P5’鏈。加入簇生成引物Read2，從相反方向進(jìn)行另一端序列讀取。
四、測序數(shù)據(jù)
以上則為二代測序的整個(gè)過程，不同的平臺會存在一些差異，但總體過程類似。測序完成后，基于文庫構(gòu)建時(shí)添加的Index分類來自不同樣本的序列，這些序列再與參考基因組匹配后，得到完整序列。